Técnicas de transformação de DNA

Métodos de transformação de plantas

As plantas transgênicas podem ser produzidas por vários procedimentos, que podem ser divididos em métodos diretos e métodos indiretos, todos são baseados na transferência de um gene isolado, para uma célula vegetal em questão, então este material genético passa a ser expresso de forma estável; após a regeneração dessa célula in vitro, esta irá gerar uma planta transgênica com uma nova informação genética, sem que haja modificação da estrutura global da planta.

Durante os procedimentos são usados genes marcadores e genes repórteres.

Gene marcador: gene que permite detectar células que carregam DNA recombinante, através da expressão de um fenótipo facilmente identificável, como, por exemplo, a resistência a determinado antibiótico.

Gene repórter: gene cuja proteína é facilmente identificada. É utilizado no estudo de seqüências de DNA que regulam a expressão gênica em determinado tecido

A escolha do método de transgênia a ser usado depende da espécie vegetal que será modificada e do objetivo da transformação, que devem analisados conjuntamente com as vantagens e desvantagens de cada procedimento.

Método indireto:

Na transgênia por procedimento indireto, há necessidade do uso de um vetor intermediário para que haja transferência do material genético; o vetor mais usado são as Agrobacterias, bactérias do solo do gênero Agrobacterium, destas as mais utilizadas são Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes.

As agrobacterias se associam geralmente em plantas dicotiledôneas, podendo ocasionar tumores na planta, durante o processo de infecção as agrobacterias podem transferir genes para a planta infectada; esses genes estão presentes em grandes plasmídeos bacterianos, sendo chamados de plasmídeo Ti (Tumor inducing = indutores de tumores) em A. tumefaciens e plasmídeo Ri em A. rhizogenes, esses genes transferidos são integrados ao DNA da planta e passam a ser expressados, levando a produção de tumores nas plantas. A transferência de plasmídeos ocorre quando a planta sofre algum ferimento, e começa a produzir compostos de proteção e cicatrização como fenóis e açúcares, a agrobacteria é atraída por estes compostos (quimiotaxia), chegando ao local de ferimento. Estes mesmos compostos ativam a região de virulência dos plasmídeos ocorrendo a transferência deste para a planta.

Para a obtenção das plantas transgênicas os genes originais que são transferidos, são substituídos por genes pré-selecionados, que possam expressar a característica desejada.

A transformação de plantas via Agrobacterium é um dos métodos mais conhecidos, estudados e usados na transgênia vegetal, devido a sua simplicidade e eficiência, e por ser relativamente barato. Contudo este método depende da susceptibilidade da planta pelas Agrobacterium.

Método direto:

Os métodos diretos não há uso de vetores intermediários para transferência dos genes, ou seja, as Agrobacterium não são utilizadas, com isso as plantas sem susceptibilidade a essas bactérias também podem ser modificadas. Os principais procedimentos são: Eletroporação de Protoplastos, Biobalística (Bombardeamento de partículas), Microijeção.

Na Eletroporação são usados protoplastos, células vegetais que não possuem parede celular, nesse processo os protoplastos são colocados em soluções que contêm os genes a serem transferidos em seguida são bombardeados com impulsos elétricos; o choque provoca a abertura momentânea da membrana celular, permitindo a entrada dos genes em questão; então os protoplastos se regeneram e podem gerar novas plantas. As vantagens deste método são a eficácia e rapidez, contudo há os gastos com o equipamento.

A Biobalística consiste no bombardeamento dos genes, que anteriormente são aderidos a partículas de ouro ou tungstênio, para dentro das células a serem modificadas. O bombardeamento é realizado através de gás hélio, pólvora ou descargas elétricas, o aparelho usado para gerar o bombardeamento é chamado de acelerador de micropartículas, após o processo de bombardeamento, que ocorre em uma câmara sob vácuo, o DNA inserido se dissocia das partículas e se integra ao genoma. A técnica de biobalística é versátil, simples e rápida.

A Microijeção é um método que inicialmente era usado apenas para transformação gênica em animais, contudo foi adaptado para o uso em transgênia vegetal; este é um método trabalhoso, mas de grade eficiência. Este procedimento consiste na microijeção direta de DNA no núcleo da célula a ser modificada, para isso são usados microcapilares, que permitem a inserção do DNA sem a inviabilização da célula. Esse método vem apresentando resultados positivos, mas é um procedimento laborioso.